流感病毒（influenza virus）是引起流行性感冒的病原体，具有高度传染性，传播速度快，抗原变异性很强（变异性最强的是甲型流感，乙型流感次之），分离培养出流感病毒毒株，对于研究其抗原变异性有非常重要的作用。

一、方法背景

流感病毒的传统分离培养方法依据培养载体的不同，可分为MDCK细胞分离培养法和鸡胚分离培养法。传统MDCK细胞分离培养法对于H3N2亚型流感病毒的分离率不及H1N1及Bv、By亚型流感病毒，毒株血凝滴度也相对较低；鸡胚培养法对目前H3N2亚型流感病毒则不敏感。目前，市面上开发出悬浮细胞法分离培养流感病毒，可提高H3N2及其他亚型流感病毒的分离率及血凝滴度。

二、基本原理

悬浮细胞法分离培养流感病毒使用的是susMDCK细胞株，该细胞株为悬浮细胞，是由MDCK细胞“驯化”而来。与传统贴壁细胞（即MDCK细胞）相比，悬浮的susMDCK细胞能增加病毒吸附表面积，提高了吸附病毒的能力。其使用的专用细胞培养液（无血清的M-SUS培养液）支持细胞高密度扩增，可直接向细胞培养液中添加TPCK胰酶和标本进行病毒分离，并可获得高效价的病毒。

三、方法步骤

与传统MDCK细胞分离培养法接近，包括细胞的培养和细胞分离病毒两大步骤，但细节有较大区别。简述如下：

（一）susMDCK细胞培养

1．复苏细胞  susMDCK细胞株自液氮罐取出后，迅速37℃水浴解冻，然后1000rpm离心5min，沉淀用1mL新鲜M-SUS培养液重悬后转移至含50mL新鲜M-SUS培养液的250mL锥形瓶中，置于37℃，5%CO₂培养箱的摇床上，摇床转速120～130rpm；

2．传代培养  震荡培养3~4天，细胞计数可达（7~12）﹡10⁶cell/mL。此时可使用新鲜M-SUS培养液将细胞稀释至（0.8~1.2）﹡10⁶cell/mL。培养条件同上；

3．细胞冻存  传代培养3天后的细胞，计数达到（7~8）﹡10⁶cell/mL时即可冻存。冻存液配制：45%条件培养液+45%新鲜M-SUS培养液+10%DMSO。

（二）susMDCK细胞分离培养病毒

选择传代培养3~4天的细胞，当细胞计数达到（7~12）﹡10⁶cell/mL时，用新鲜M-SUS培养液稀释至（3.0~3.5）﹡10⁶cell/mL，加入适量TPCK胰酶和三抗后，直接加入适量待检标本即可。分离培养条件：37℃，5%CO₂，摇床转速220rpm。培养几天后便可收获及鉴定。

四、优缺点

因与病毒接触面积增大，理论上悬浮细胞法能提高分离培养流感病毒的阳性率。此外，susMDCK细胞传代只需稀释，无需胰酶消化；标本接种无需繁琐的洗涤和吸附步骤，直接加入待分离标本即可；而且，根据实验进展随时可以吸取上清进行血凝试验，方便监测滴度以满足送检要求。

该方法不足之处在于：须增加一定的硬件配置（温箱内专用摇床）；且如果实验人员经验不足，则需花费精力进行细胞计数及细胞活力检测来了解细胞生长状态。

目前我中心实验室仍采用传统MDCK细胞及鸡胚分离培养法来分离培养流感病毒，同时也采购了相关试剂耗材尝试用悬浮细胞法来进行susMDCK细胞传代培养及病毒接种工作。方法摸索成熟并采用后预期会提高我中心流感病毒毒株的分离效率。