流感病毒实验室诊断方法简述
流感病毒实验室诊断方法简述
  • 2018-03-08 03:00
  • 来源: 微生物检验所
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流感病毒(influenzavirus)是引起流行性感冒的病原体,分为甲、乙、丙三种型别,其中,感染禽类的甲型流感病毒称为禽流感病毒。甲型流感病毒变异性最强,常引起地区甚至是世界性大流行;乙型病毒变异性较弱,常引起中度流行或局部暴发;丙型病毒抗原性比较稳定,多引起婴儿或成人散发。目前检测流感病毒的实验室方法主要有病毒分离鉴定、血清学检测以及分子生物学检测方法等。

一、病毒分离鉴定

有条件的实验室可同时采用细胞和鸡胚两种方法进行病毒分离。MDCK细胞培养法:MDCK细胞对流感病毒很敏感,将处理过的标本接种于长成单层的MDCK细胞管,33-35培养48-72小时,观察细胞病变(CPE),如阳性则测定上清液的血凝效价,用血凝抑制试验(HI)分型;鸡胚培养法:将样本液同时接种于羊膜腔和尿囊腔,33-35培养48小时(甲型流感毒)或72小时(乙型流感病毒),分别收获尿囊液和羊水并作初步血凝试验,以鉴定流感病毒的存在,用血凝抑制试验(HI)分型。

二、血清免疫学检测

分为HI抗体检测和中和抗体检测。HI抗体检测:采集病人急性期和恢复期双份血清,如恢复期血清抗体效价较急性期抗体效价升高4倍或4倍以上有诊断意义;中和抗体检测:病毒中和试验是敏感而特异的血清学方法,可直接评价血清对病毒的中和保护能力,是检测抗体与病毒作用的经典方法,其原理是:当血清中的特异抗体与病毒的表面抗原相结合,使病毒失去感染宿主细胞的能力,从而抑制细胞病变的产生,通常以100TCID50/50ul的已知流感病毒液对照孔细胞出现完全病变时判定结果,以抑制病毒增殖的血清最高稀释度为终点,即为待测血清中和抗体效价。

三、分子生物学检测

分子生物学方法敏感、快速,能直接检测临床标本,可用于调查呼吸道疾病爆发流行的病因,比较新变异株和疫苗株基因序列的差别,研究病毒基因进化等。但分子生物学方法不能直接研究病毒抗原性变异情况以及人群对新变异株的免疫能力,因此,分子生物学方法可以用作常规病毒诊断的辅助手段,尤其在流感疫情的应急快速诊断上,发挥着重要作用。分为RT-PCR和实时荧光定量PCR两种方法。目前,其中实时荧光PCR检测流感病毒核酸多被疾控中心用于流感疫情检测,其原理是在PCR反应体系中加入荧光基团,当外来光源激发供体荧光染料发出荧光,其发射波长与受体荧光染料的吸收波长部分重叠,且两者距离很近时,受体荧光染料吸收供体荧光传递的能量而激发出另一波长的荧光,同时将供体荧光淬灭,利用荧光信号累计实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。该方法具有直观性、重复性好、特异性强、敏感性高和易操作的特点,可动态实时监测核酸产物的形成,无需后处理过程,避免了扩增产物的污染,缩短了检测时间,并且其敏感性、特异性均优于通常的PCR反应。

目前,我中心微检所已于2010年开始应用实时荧光PCR检测流感病毒核酸来应对流感疫情和流感监测,特别是应对流感疫情,其方法效果敏感、快速,最大限度减少了扩增产物交叉污染风险,提高了准确度;2012年开始,我中心微检所在继续开展MDCK细胞法培养流感病毒的基础上,开始试行用鸡胚法分离培养流感病毒,2015年,通过派遣专业技术人员到省疾控中心认真学习鸡胚双腔盲种法,加上技术人员从鸡胚孵育、检卵、开卵、羊膜腔和尿囊腔接种技术、羊水和尿囊液的收获方法,特别是对众多一代血凝结果阴性的培养液中有针对性的选材进行二代培养等等各个环节,进行了一系列摸索,获得了大量实践经验,近两年我中心的流感病毒鸡胚毒株分离率得到了极大提升,流感鸡胚毒株分离率排名进入全省各地市前列。

(市疾控中心陈仲威)

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