登革病毒的实验室检测方法概述
  • 2017-08-28 07:13
  • 来源: 微生物检验所
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  登革热(Dengue fever)是由登革病毒引起的急性传染病,主要通过白蚊伊蚊及埃及伊蚊叮咬后传播。广泛流行于全球热带和亚热带地区,是分布最广,发病最多,危害较大的一种虫媒病毒性疾病。登革病毒属于黄病毒科、黄病毒属。根据其特异性抗原的不同,可分为4个血清型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ,它们与其他黄病毒属的病毒之间,在血清学试验中可有广泛的免疫交叉反应。
  登革病毒的检测方法包括病毒核酸检测、病毒分离、血清抗体检测3种。发病7天内采的急性期血清,可同时采用上述3种方法检测病毒,发病后8~13天的早恢复期血清及14~30天采的晚恢复期血清仅检测血清抗体。
  一、分子检测
  登革病毒含RNA基因组,因此PCR前需经过逆转录酶作用,合成第一条cDNA链(RT),再进行扩增(PCR),即RT-PCR。设计一对通用引物可扩增登革病毒组基因。设计不同型登革病毒的引物对,可扩增出不同的基因型病毒的基因产物。根据基因扩增产物的片段大小可判断是否登革病毒或某一型登革病毒。
  以荧光PCR反应的前3~15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,以本底信号标准差的10倍作为荧光阈值,样本扩增产生的荧光信号达到荧光阈值时所对应的循环数为循环阈值(Ct值),以Ct<40、荧光信号数据线性化处理后对应循环数产生的曲线图呈“S”形的样本可判断为相应的登革病毒核酸检测阳性。
  二、血清抗体检测
  根据抗原抗体特异性结合的原理,利用抗人IgM抗体μ链单克隆抗体捕获待检测血清中的登革病毒IgM抗体,再加入特异性登革病毒抗原和相应酶标登革病毒单克隆抗体,加底物显色。显色程度与特异性IgM抗体含量呈正相关。IgM抗体阳性,表示患者新近感染登革病毒,此法适用于登革病毒早期诊断。
  登革IgG间接ELISA试剂盒用于定性检测血清中针对Ⅰ~Ⅳ型登革抗原的IgG,该检测作为临床对于有临床症状的患者及既往暴露于登革热的患者的辅助诊断。也可以用于区分原发感染和继发感染。
  三、病毒分离鉴定
  登革病毒是一种严格的细胞内存活的生物,必须生活在活的细胞组织内,C6/36白纹伊蚊细胞对登革病毒十分敏感,根据观察病毒对其产生的细胞病变效应(CPE),以及使用特异、敏感的检测技术,检测病毒的存在和型别。
  应用间接免疫荧光试验(FA/IFA)可快速地鉴定细胞分离培养的登革病毒。特异性免疫荧光呈黄绿色颗粒,分布在感染细胞的胞浆内,正常组织细胞被染成橙红色或暗红。
  目前,市疾控中心微检所采用RT-PCR技术检测登革病毒RNA及型别鉴定;应用IgM捕捉酶联免疫吸附试验检测IgM抗体,用于早期诊断;应用间接酶联吸附试验检测IgG抗体;采用C6/36白纹伊蚊细胞对登革病毒进行分离鉴定。
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