鸡胚培养技术在流感病毒检测中的应用
  • 2017-10-25 03:06
  • 来源: 微生物检验所
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  鸡胚是正处于发育的机体,组织分化程度低,细胞代谢旺盛,适于许多人类和动物病毒及立克次体的生长繁殖,虽因组织培养技术的不断发展,鸡胚培养技术被组织培养方法所取代,但在痘类病毒、黏液病毒和疱疹病毒的研究上,鸡胚培养仍很重要,常用于这类病毒的分离、鉴定、抗原制备、疫苗生产以及病毒性质等方面的研究,在禽类病毒研究中的应用也较多。
  一、鸡胚培养技术概述
  鸡胚培养技术的优点是来源充足、价格低廉、操作简单、无需特殊设备或条件、易感病毒谱较广,可选择适当途径接种,病毒易于繁殖,感染病毒的膜和液体含有大量病毒,可用于进一步的研究,通常对接种的病毒不产生抗体。其缺点是除产生痘疱的病毒及引起鸡胚死亡的病毒外,不产生特异性的感染指征,须利用第二试验系统来测定病毒的存在;家禽饲料中含有的抗生素可传递给鸡胚,特别是含四环素的饲料可使鸡胚对立克次体和一些鹦鹉热病原体的感染产生抵抗。因此,用鸡胚分离培养病毒时,原则上应使用非免疫受精鸡卵,最好用SPF受精鸡卵。
  二、鸡胚的结构和生理
  鸡胚胎由外胚层、中胚层和内胚层三个胚层发育而来,它们构成胚胎的组织与器官,一般孵育9~11d龄鸡胚可见膜腔位置及胚胎各部的构造。
  鸡胚最外层为石灰质的卵壳,下层为壳膜。卵壳上的细孔可进行气体交换,壳膜使气体分子和液体分子在鸡胚内进行交换。因此,在孵育鸡胚时,需要一定的湿度和气流,如果湿度太低,鸡胚容易脱水;如空气不流通,亦可造成鸡胚死亡。壳膜之下为血管丰富的绒毛尿囊膜,外为绒毛膜,内为尿囊膜,绒毛尿囊膜起着胚胎呼吸器官的功能,氧气的交换是在膜的血管内通过卵壳孔进行的。尿囊腔是胚胎的排泄器官,内含尿囊液,初为单纯生理盐水,随尿囊液中尿酸盐迅速增加,胚胎发育到第12~13d后,尿囊液开始变得浑浊。尿液量在鸡胚发育的第11~13d平均为6~6.5ml。羊膜为胚胎最内层包被,盛有羊水,胎体浸泡于其中,羊水量平均为1ml左右。附着于胚胎的是卵黄囊,内包卵黄,是胚胎发育早期的养料。

  三、鸡胚培养用于流感病毒检测
  用于鸡胚培养的受精鸡卵最好是健康莱亨鸡卵,需要新鲜的受精鸡卵,以保证鸡胚的孵出率,要求受精鸡卵在产出后的保存时间≤10d,最好在7d以内,保存温度在10℃左右。基本步骤包括:检卵和消毒、接种、培养、收获。鸡胚培养常用的接种途径有4种,即绒毛尿囊膜接种、尿囊腔接种、羊膜腔接种、卵黄囊接种。根据病毒的不同,试验目的的不同,以及标本来源的不同,选择不同的途径接种鸡胚。
  流感病毒一般采用尿囊腔接种和羊膜腔接种。接种的材料为患者含漱液、咽拭子样本,震荡混匀并加抗生素进行处理;取9~12d龄发育良好的鸡胚,将处理过的样本液在羊膜腔和尿囊腔各接种0.2ml;每份样本3~4只鸡胚,置33~35℃温箱培养,甲型流感病毒一般培养48h,乙型流感病毒培养72h;鸡胚4℃放置过夜(或-20℃放置1h)后分别收获尿囊液和羊水,并作红细胞凝集试验(HA)。通过HA检测流感病毒的血凝滴度,如血凝阴性,可盲传2代,如仍为阴性则可弃之;如具有一定的HA滴度即可进行血凝抑制试验(HI)进行流感病毒型别的鉴定。


 

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