第三代测序技术是指单分子实时测序技术，也叫从头测序技术。与前两代测序技术相比，其最大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序。就当前形势来看，第二代短读长测序技术在测序市场上仍然占有绝对优势，但第三代测序技术近年来也发展的如火如荼。英国牛津纳米孔公司所开发的纳米孔（Nanopore）测序技术便是三代测序中的中流砥柱。

纳米孔测序原理，顾名思义，核心就是利用一个纳米孔，孔内共价结合有分子接头，将纳米孔蛋白固定在电阻膜上后，再利用动力蛋白牵引核酸穿过纳米孔。当核酸通过纳米孔时使电荷发生变化，从而引起电阻膜上电流的变化。由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过，而ATCG单个碱基的带电性质不一样，因此不同碱基通过蛋白纳米孔时对电流产生的干扰不同，通过实时监测并解码这些电流信号便可确定碱基序列，从而实现测序。

三代测序主要优势：1．长读长,Reads可达Mb；2．设备成本低,测序芯片可清洗再生，重复利用；3．实时获得序列信息,最快可在1小时内完成测序流程及数据分析，满足动态检测宏基因组需求；4．便携式测序装置,重量轻且占用空间小，可以随身携带随时测序；5．直接测序,直接测序原始DNA和RNA，不需要进行PCR扩增，避免了扩增偏好性；保留了原始碱基修饰信息，能够直接读出甲基化的胞嘧啶。

三代测序的应用前景非常广阔，1．大基因组拼接：在以往基于短片段的基因组拼接中，由于一些动植物基因组本身具有多倍体，高度重复，高度杂合的特性，导致基因组拼接异常艰难。而三代测序技术具有长读长的特点，利于大基因组的拼接，可以极大的提高基因组的完整性。2．全长转录组：以往的转录组分析由于无法直接对RNA进行测序，往往需要先对mRNA进行打断，再反转录为cDNA，无法获取和分析全长转录本。三代测序的长读长特点可以准确识别各基因的多个同源异构体，简单准确；并且可以直接测序RNA，直接识别RNA的碱基修饰。3．大片段结构变异：基因组上会产生很多与人类疾病相关的大片段结构变异（如缺失、倒位和易位等），短测序读长无法准确检测这些变异，而三代测序测序的读长较长，适合进行大片段结构变异的检测，在疾病研究等方面具有良好的发展前景。4．微生物快速鉴定：由于三代测序测序具有实时，快速的特点，可以在采集点直接进行测序，实时得到序列信息进行物种分类鉴定，完成微生物的快速鉴定。目前，我中心实验室采购了Nanopore GridIon三代测序仪，已正式投入使用，技术人员经过培训后，熟悉掌握整个实验流程和仪器的操作。在新冠病毒变异监测项目和猴痘病毒测序方面都有应用，并获得多例新冠和猴痘的全基因组序列。