自从PCR技术问世以来，随着技术的推广和应用，派生了许多适用于不同目的的改良方法和技术，如模板为RNA的逆转录PCR（Reverse Transcriptase PCR，RT-PCR）；能同时检测不同目的基因的多重PCR（multiplex PCR）；能提高扩增反应的敏感性和特异性的巢式PCR（nested PCR）；通过检测荧光素、或同位素、或酶活性来显示目的片段存在的标记引物PCR（Labeled Primers PCR）；将抗原抗体的特异性反应与PCR技术结合起来，以检测微量蛋白质的免疫PCR（IM-PCR）以及能对待测模板定量的实时荧光定量PCR等等。
实时荧光定量PCR是指在PCR体系中加入荧光基团，使PCR产物和荧光相关，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且整个PCR过程可实现自动化，且耗时短，操作方便，不易污染。
一、定量原理
实时荧光定量PCR是利用荧光信号的变化，实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。
1．扩增曲线
在实时荧光定量PCR进程中，通过荧光定量PCR仪，在PCR每个循环进行一次荧光信号的收集，以荧光强度为纵轴，循环次数为横轴，所得到的曲线称为PCR的扩增曲线。
2．荧光阈值
实时荧光定量PCR的前面十多个循环，荧光强度变化不大，荧光强度的平均值可称为基线值，在基线值的基础上，增加一定数量后得到一荧光值，这一点后，随着循环次数的增加，荧光强度明显增强，因此称该值为荧光阈值。一般取PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号。
3．Ct值与标准曲线
Ct值是指PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。实验发现，Ct值与反应管内的模板数密切相关，起始拷贝数越多，Ct值越小。
二、分类与工作原理
根据引入荧光标记的类型，常用的实时荧光定量PCR有以下几种：SYBR Green法、水解探针法（TaqMan法）、分子信标法等。
1．SYBR Green法
SYBR Green是一种荧光染料，在PCR反应体系中，加入过量的SYBR Green荧光染料，该染料特异性地掺入DNA双链后，发出荧光信号，未掺入链中的SYBR Green染料分子不发出任何荧光信号。因此，PCR产物越多，荧光越强，荧光信号的增加与PCR产物的增加同步。
SYBR Green法可以用于各种扩增产物的定量，只要最后产物是双链DNA,这既是其主要优点，也是主要的缺陷，即不能区分扩增产物的特异性，只要是双链DNA，结合SYBR Green后都能发出荧光。
2．TaqMan法
TaqMan法属于特异性荧光探针中的水解探针法。探针的序列和待扩增片段的一段互补，在复性或者退火的时候，与DNA模板发生特异性杂交，在延伸期，随引物延伸，Taq酶沿DNA模板移动，当移动到TaqMan探针的位置，Taq酶的活性发挥作用，水解切断探针，释放荧光发射基团，淬灭作用被解除，荧光信号释放出来。模板每复制一次，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光集团数目和PCR产物数量是一对一的关系，因此用该技术可对模板进行准确定量。同时TaqMan法对目标序列具有高特异性，探针设计相对简单，重复性比较好。
3．分子信标法
分子信标示一种可以特异识别核酸序列的新型荧光探针，这种荧光探针通过与核酸靶分子进行杂交后构象发生变化而发出荧光。该技术是Sanjay Tyagi于1996年首次发明，具有背景信号低，灵敏度高，特异性识别性强，操作简单以及不必与未反应的探针分离即可实时检测等优点，在短短几年里得到迅速发展，在微生物检验中得到广泛应用，如用于快速定量检测单增李斯特菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌O157：H7和志贺菌等。
三、实时荧光定量PCR的特点
实时荧光定量PCR由于荧光探针的应用，可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果，克服了常规PCR的很多缺点，以下是它的特点：
1．封闭反应，无需PCR后处理
常规PCR产物需通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色紫外光观察结果或通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测，不仅需要多种仪器，而且费时费力，所使用的染色剂溴化乙锭对人体又有害，繁杂的实验过程增加了污染和假阳性机会。实时荧光定量PCR在加样后的过程完成闭管操作，不需要PCR后处理，使该技术更简单、更快速、操作更安全、假阳性率更低，因此结果更可靠。
2．定量准确
实时荧光定量PCR是利用荧光信号的变化，实时监测PCR扩增反应中每一次循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析，克服了传统的基于反应产物进行定量的缺陷，避免了酶活性差异对定量结果的影响，使对原始模板的定量更准确，而且结果重现性好，定量范围宽。
3．结果观察和记录自动化
仪器在线式实时检测，结果直观，避免人为判断的失误，结果数据可长期保存。
4．工作效率高，利于实现高通量检测
实时荧光定量PCR仪通过电脑控制，1—2h全自动同步完成48—96个样品的扩增和定量检测；如果能多通道收集荧光信号，还可实现一管双检或多检。利于实现对病原微生物的快速高通量检测。
