结核分枝杆菌的实验室检查
  • 2021-02-19 17:07
  • 来源: 微生物检验所
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结核病是一个非常古老而迄今仍然威胁人类健康的重要疾病和重大公共卫生问题,是全球前10位死因之一。随着我国防治工作的推进,我国结核病的发病率正在下降,但仍是结核病高负担国家,结核病防控任务依然艰巨。

结核病是由结核分支杆菌感染引起的慢性传染病。结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis简称结核杆菌,可以引起人和动物结核病。本菌可通过呼吸道、消化道或皮肤黏膜损伤进入机体,主要侵犯肺脏,称为肺结核病,也可侵犯肺脏以外的其他部位如肝、肾、脑、淋巴结等器官,称为肺外结核病。该病在古代被称为“痨病”。

一、生物学特性

(一)形态与染色

结核杆菌为细长略带弯曲的杆菌,呈单个或分枝状排列,无荚膜、无鞭毛、无芽孢。结核杆菌在体内外受物理、化学、免疫等因素的影响,维持菌体固有形态的细胞壁缺损或丧失,产生细胞壁缺陷型,称为L型菌。L型菌一般呈球状体,但同时也存在长丝体、巨球体等形态。

结核杆菌革兰染色阳性,但因其细胞壁含大量脂类通常难以着色,而在加温条件下经苯胺染料染色后,用酸或酸酒精脱色,仍能保留一定的染料。这种特性称为抗酸性,因此结核杆菌又称抗酸杆菌。结核杆菌经抗酸染色后呈红色,标本中其他细菌、细胞和杂质等均呈蓝色。而缺失细胞壁的L型菌抗酸性退行性改变,甚至可完全丧失,抗酸染色呈阴性。此外,结核杆菌还可用金胺“O”等染色,在荧光显微镜下菌体可发生荧光呈橘黄色。

(二)培养特性

结核杆菌为专性需氧菌,在无氧条件下迅速死亡,在3%~5%CO2环境下能促进生长。营养要求较高,最适宜的生长温度为35~37℃,低于30℃不生长。生长时还需要一定的湿度。故固体培养基培养时,需要有适量的凝固水以保证培养基湿度。初次分离需要营养丰富的培养基。常用的有改良罗氏固体培养基。因结核杆菌细胞壁的脂质含量较高,影响营养物质的吸收,故生长缓慢。在培养基上一般需2~4周或更长时间才出现肉眼可见的菌落。典型菌落为干燥、坚硬、表面呈颗粒状、乳酪色或黄色,形似菜花样。在液体培养基中可能由于接触营养面大,细菌生长较为迅速,呈粗糙皱纹状菌膜生长,一般1~2周即可生长。

(三)免疫性

结核杆菌是胞内感染菌,其免疫主要是以T淋巴细胞为主的细胞免疫,体液免疫只是起辅助作用。结核的免疫只有当机体细胞内存在结核杆菌或其组分时才有免疫力,一旦结核杆菌被完全杀灭,其组分被完全清除后,相应的免疫力也随之消失,故结核的免疫被称为感染免疫或带菌免疫。

(四)抵抗力

结核杆菌因细胞壁中含有大量脂类,尤其是蜡样物质,具有疏水性,故对物理或化学的抵抗力均较一般的致病菌强,但对乙醇敏感,在70%~75%乙醇中数分钟即被杀死。此外,脂质可防止菌体水分丢失,故对干燥的抵抗力特别强。干热对结核杆菌杀伤力弱,痰内结核杆菌在100℃下需要4~5小时才能被杀灭。湿热对结核杆菌杀伤力强,因此煮沸与压力蒸气消毒是最有效的方法之一。结核杆菌还对紫外线敏感,直接日光照射数小时可被杀灭,可用于结核患者衣服、书籍等的消毒。

二、实验室检查

在结核病的实验室诊断工作中,最常用的标本是痰标本,但由于结核杆菌可以感染肺部以外脏器而造成肺外结核病,在进行临床诊断和实施治疗时也需要对相应病灶部位的适当标本进行检查。一般的样品类型有:痰液、病灶组织、胸腹水、尿液、脑脊液、血液和血清等。

目前结核杆菌的实验室检查方法有以下四种:显微镜检查法、分离鉴定、分子生物学检测和免疫学检测。

(一)显微镜检查法

痰涂片显微镜检查是发现传染性肺结核病人最简单、有效的实验室诊断方法。是WHO和我国结核病防治规划推荐的结核病实验室首要细菌学检查技术。

(二)分离鉴定

进行分离培养的标本应尽量在未使用抗结核药物之前采集。治疗中的肺结核病人应停药48小时后再采集痰标本。为了避免污染菌大量繁殖,标本采集后应尽快送检并完成检查操作程序。进行分离培养的标本,在标本采集后的72小时内必须完成前处理和接种程序。

结核杆菌分离培养检查法,是结核病确诊最可靠的方法,是结核病病原学诊断的“金标准”,也是获得纯培养物进行菌种鉴定、药物敏感性试验以及其他生物学研究的基础。我国推荐使用罗氏培养基简单法进行培养。

(三)分子生物学检测

目前,以核酸为基础的分子生物学检测技术在结核病细菌学领域进展很快,在结核杆菌快速诊断、菌种鉴定、耐药性检测和基因分型等方面被广泛应用。其中聚合酶链反应PCR及其衍生技术已经被广泛应用于临床检测中,成为结核病分子诊断的主要方法。

(四)免疫学检测

结核杆菌感染人体后,刺激人体免疫系统,产生一系列细胞免疫和体液免疫反应。近年来的研究表明活动性结核病人细胞免疫随病变加重而减弱,体液免疫随病变加重而增强,产生特异性结核抗体,这种细胞免疫和体液免疫的分离现象非常明显。因此,可用已知的结核抗原来检测待检标本中是否存在特异性升高的结核抗体及其含量从而辅助诊断结核病。


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